...長因子受體 3在頭頸部鱗癌中的表達及其意義.pdf
周宏 李文平 裴斐 吳剛
[摘要] 目的 探討ANO1在頭頸部鱗癌中的表達及與患者預后的關系。 方法 運用Oncomine數據庫分析ANO1 mRNA在頭頸部鱗癌組織與正常黏膜組織表達的差異性及與預后的關系。收集2017年2～10月在復旦大學附屬浦東醫院接受手術的喉癌患者的標本，采用RT-PCR檢測ANO1 mRNA在喉鱗癌組織（26例）與正常黏膜組織（26例）中的表達情況。檢索cBioPortal數據庫，分析ANO1 mRNA在頭頸部鱗癌中的表達與預后的相關性。 結果 在多種頭頸部鱗癌組織中ANO1 mRNA表達顯著高于正常黏膜組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。運用Rickman數據集分析發現ANO1 mRNA高表達與低表達患者的5年總生存率差異無統計學意義（P ﹥ 0.05），而從cBioPortal數據庫（TCGA，Provisional）分析發現ANO1 mRNA高表達與低表達的總生存率、無疾病/進展生存率差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 ANO1在頭頸部鱗癌組織中的表達高于正常黏膜組織，ANO1高表達的患者，生存期較短，預后較差。
[關鍵詞] ANO1；頭頸部鱗狀細胞癌；預后；數據庫
[中圖分類號] R739.91 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（c）-0017-04
Expression of ANO1 and its correlation with the prognosis of head and neck squamous cell carcinoma
ZHOU Hong LI Wenping PEI Fei WU Gang
Department of Otorhinolarygology Head and Neck Surgery， Fudan University Pudong Medical Center， Shanghai 201399， China
[Abstract] Objective To investigate the expression of ANO1 in head and neck squamous cell carcinoma （HNSCC） and to determine the prognostic value of ANO1 for HNSCC patients. Methods The differences of ANO1 mRNA expressions in HNSCC and normal mucosa tissues were analyzed based on Oncomine database. The specimens of patients undergoing surgery with laryngeal cancer in Fudan University Pudong Medical Center from February to October 2017 were collected. ANO1 mRNA expressions in laryngeal cancer （26 cases） and normal mucosa tissues （26 cases） were determined using RT-PCR. The relationship between ANO1 mRNA expression and prognosis of HNSCC patients was analyzed using Oncomine and cBioPortal database. Results The mRNA expression of ANO1 was significantly higher in multipe HNSCC tissues than normal mucosa tissues （P < 0.05）. Using Rickman statistics， there was no significant difference in 5-year overall survival （OS） between ANO1 mRNA high expression and low expression patients （P ﹥ 0.05）. However， there were significant differences in OS and disease/progression-free survival （DFS/PFS） between ANO1 mRNA high expression and low expression patients through searching cBioPortal database （TCGA， Provisional） （P < 0.05）. Conclusion The expression of ANO1 is elevated in HNSCC tissues. Patients with high expression of ANO1 had lower survival than those with low expression.
[Key words] ANO1； Head and neck squamous cell carcinoma； Prognosis； Database、
頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是世界第6大常見的好發腫瘤[1]，從解剖位置上包括口咽癌、下咽癌、鼻咽癌、口腔癌和喉癌。據統計，2017年在美國有超過60 000的HNSCC新患者被發現，并且大約有13 000患者死于該疾病[2]。研究證實，HNSCC的發生與煙草、酒精及人類乳頭狀病毒感染密切相關[3]。目前，早期HNSCC的治療主要以手術和單獨放療或者同步放化療為主，晚期HNSCC以多學科綜合治療為主。盡管治療手段的多樣性，但患者的生存率還是比較低。越來越多的研究表明，生物分子物的檢測可以評估頭頸部腫瘤的預后。
ANO1又稱為跨膜蛋白16A，是鈣離子激活氯離子通道蛋白家族成員之一[4]。ANO1在體內承擔多種生理功能：離子轉運、調節其他離子通道、平滑肌收縮、神經元興奮性控制、細胞增殖和信號傳導等[5]。同時，ANO1在多種惡性腫瘤中的作用也得到較大的關注。在惡性腫瘤中由于11q13染色體擴增而呈高表達，參與腫瘤的發生發展過程，且與預后相關[6]。因此，本研究進一步探討ANO1在HNSCC中的表達情況及與患者預后的相關性。
1 資料與方法
1.1 從Oncomine數據庫提取數據
Oncomine數據庫（www.oncomine.org）是一個癌基因芯片數據庫，主要提供腫瘤基因的相關信息。在本研究中設定篩選條件：①Gene：ANO1；②Cancer Type：Head and Neck Cancer；③Data Type：mRNA；④Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysia；⑤Clincal Outcome：Survival Status at 5 Years。通過選擇ANO1在癌組織與正常黏膜組織之間表達的倍數關系、P值來顯示結果，分析在ANO1 mRNA水平上HNSCC與正常黏膜表達的差異性及與預后的關系。
1.2 從cBioPortal 數據庫提取數據
cBioPortal數據庫（www.cbioportal.org）整合了癌癥基因圖譜（TCGA）和國際癌癥基因組聯盟（ICGC）等多個數據庫的數據，主要提供癌癥基因組數據、綜合分析基因組數據和臨床資料等。檢索cBioPortal數據庫，依次勾選Head and Neck；Head and Neck Squamous cell carcinoma（TCGA，Provisional）；mRNA Expression z-Scores（RNA Seq V2 RSEM），輸入基因ANO1，獲得與ANO1基因相關的數據，分析ANO1 mRNA在HNSCC中的表達與預后的相關性。
1.3 RT-PCR方法檢測ANO1 mRNA在喉鱗癌中的表達情況
病例標本來源于2017年2～10月在復旦大學附屬浦東醫院接受手術的26例喉癌患者，其中男24例，女2例；年齡42～75歲，平均63.5歲；病例分期按國際抗癌聯盟（UICC）2002分期標準進行，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例。術前未行放化療，術后組織病理診斷均為喉鱗狀細胞癌，為原發腫瘤。術中快速將配對的癌組織和癌旁正常黏膜組織標本裝在2 mL凍存管中，標記后快速放進液氮罐，在-80℃冰箱保存備用。
采用Trizol法提取喉癌組織及正常黏膜組織中的總RNA。用Qiagen公司反轉錄試劑盒將mRNA轉錄為cDNA，以cDNA為模板，在ABI ViiA7實時定量PCR儀（美國ABI公司）中進行后續定量PCR反應。引物購置生工生物工程（上海）股份有限公司，ANO1基因及內參的引物序列如下：ANO1引物：上游5′-CTCCTGGACGAGGTGTATCG-3′，下游5′-GAACGCCACGTAAAAGACGG-3′。GAPDH引物：上游5′-TG？鄄CCCTCAACGACCACTTT-3′，下游5′-GGTCCAGGGG？鄄TCTTACTCCTT-3′。反應結束后，用溶解曲線分析擴增產物的特異性，以2-△△Ct法分析癌組織中ANO1的表達相對于正常黏膜組織中的變化倍數，以此表示目的基因ANO1的相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 ANO1在HNSCC中的表達特征
通過檢索Oncomine數據庫，獲得了在HNSCC中ANO1 mRNA表達顯著高于正常黏膜組織。在Ye數據集中[7]，ANO1 mRNA表達在舌鱗癌（26例）較正常舌黏膜（12例）升高3.824倍（P=4.49），見圖1。在Toruner數據集中[8]，ANO1 mRNA表達在口腔鱗癌（16例）較正?？谇火つぃ?例）升高1.712倍（P=0.027），見圖2。通過RT-PCR檢測，ANO1 mRNA表達在喉鱗癌（26例）較正常喉黏膜（26例）表達顯著上調，倍數變化為2倍，差異有統計學意義（P < 0.001），見圖3。
2.2 ANO1表達與HNSCC患者的相關性
通過Oncomine數據庫檢索及臨床標本的實驗，證實ANO1 mRNA在不同部位的HNSCC中表達較正常黏膜組織顯著增高，同時，在Oncomine數據庫Rickman等[9]的研究中，提取ANO1與HNSCC預后相關的數據，得出Kaplan-Meier生存曲線，ANO1 mRNA高表達與低表達患者的5年OS差異無統計學意義（P=0.0699）。見圖4。
通過檢索cBioPortal數據庫（TCGA，Provisional），收集530例樣本ANO1基因表達數據，按照表達高低分為高表達組（141例）和低表達組（389例），分析ANO1 mRNA表達與患者預后的相關性，得出Kaplan-Meier生存曲線。結果顯示，ANO1 mRNA高表達與低表達患者的OS、DFS/PFS差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖5、6。
3 討論
HNSCC具有高發病率和死亡率，嚴重威脅人類健康。據統計，61%的HNSCC患者會出現復發，高達26%的患者發展為遠處轉移[10]。盡管有多種治療方法：手術、放化療、靶向治療、免疫治療等，但HNSCC患者5年OS仍不高，為40%，復發和遠處轉移成為預后差和致死的主要原因[11]。研究表明，HNSCC的發生發展與許多重要的癌基因發生突變及表達異常密切相關[12]。因此，尋找一種分子標志物對評估HNSCC患者預后有非常重要的作用。
ANO1基因定位于11q13.3，編碼含8個跨膜結構域的膜蛋白[13]。ANO1在維持生理功能上起著重要的作用，其陰離子轉運功能已在小鼠心肌細胞的實驗中證實[14]。同時，ANO1在惡性腫瘤的發生發展中起著一定的作用。ANO1在乳腺癌[15]、食管鱗癌[16]、前列腺癌[17]、肺癌[18]等腫瘤中高表達，且與患者的淋巴轉移和不良預后相關。有學者發現[19]，ANO1通過其氯離子通道蛋白的活性發揮促進腫瘤細胞增殖的作用，故被認為是極好的腫瘤分子標志物。
本研究通過挖掘Oncomine數據庫及對臨床標本的檢測分析了ANO1分別在舌鱗癌、口腔癌、喉鱗癌和正常黏膜組織的差異性表達，發現ANO1在HNSCC中的表達水平顯著高于正常黏膜組織。同時，通過Oncomine數據庫分析了ANO1表達與預后的關系，發現ANO1高低表達與預后無顯著相關性，推測研究納入的研究對象較少，而出現無顯著相關性。而通過cBioPortal數據庫分析，發現ANO1高低表達與患者預后顯著相關，ANO1高表達患者，預后較差。因此在HNSCC中，ANO1通過一定的機制影響腫瘤的發生發展。
綜上所述，本研究報道了ANO1在HNSCC中的表達顯著高于正常黏膜組織，ANO1高表達的患者生存期較短，預后較差。因此有必要進一步研究其作用于腫瘤的機制，對改善患者預后的研究具有一定的理論指導意義。
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（收稿日期：2018-03-10 本文編輯：任 念）
