葛根素口服微乳在Caco2細胞模型中攝取特性與研究.pdf
郭閃 田春鴻 賀元 張曉霞 田莉
摘要：目的 研究芹菜素在Caco-2細胞的攝取特性。方法 采用Caco-2單層細胞模型，研究芹菜素在不同時間、濃度、溫度、pH值、P-糖蛋白抑制劑條件下對細胞攝取的影響，采用HPLC測定芹菜素在細胞中的含量。結果 芹菜素在0.33～80 ?g/mL范圍內線性關系良好（r=0.999 4）。芹菜素在Caco-2細胞的攝取呈現一定的時間、濃度和pH值依賴性，且P-糖蛋白抑制劑不能增加其攝取量。結論 該方法操作簡單、靈敏，P-糖蛋白未參與芹菜素的轉運過程，芹菜素在Caco-2細胞的攝取主要是被動轉運。
關鍵詞：芹菜素；Caco-2細胞；攝?。桓咝б合嗌V法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.017
中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0074-05
Uptake Study on Apigenin in Caco-2 Cells
GUO Shan1， TIAN Chun-hong2， HE Yuan1， ZHANG Xiao-xia1， TIAN Li1，3
1. College of TCM， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；
2. Midong District Traditional Chinese Medicine Hospital of Urumqi， Urumqi 831400， China；
3. Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formula， Urumqi 830011， China
Abstract： Objective To study the uptake property of apigenin in Caco-2 cells. Methods Caco-2 cell monolayer model was used to research the effects of apigenin on cell uptake in different times， concentrations， temperatures， pH values， and P-gp inhibitors. HPLC was used to determine the content of apigenin in cells. Results The linearity of apigenin concentration curve was found in good linear range of 0.33–80 ?g/mL （r=0.999 4）. Uptake determination of apigenin in Caco-2 cells depended a certain of time， concentration and pH values， and P-gp inhibitors could not increase the apigenin uptake. Conclusion This method is simple and sensitive. P-gp is not involved in apigenin transport process， and uptake of apigenin in Caco-2 cells is mainly passive transported.
Keywords： apigenin； Caco-2 cells； uptake； HPLC
芹菜素是一種廣泛分布于水果、蔬菜、豆類、茶葉、中藥材中的黃酮類化合物，芹菜中含量最高。芹菜素的藥理活性較為廣泛，具有明確的抗腫瘤、抗氧化、降壓、抗炎、抗菌、抗病毒及心腦血管保護等藥理作用[1-2]，是一種具有研究潛力的活性成分。芹菜素在高親水性和非極性溶劑中的溶解性差，幾乎不溶于水，但可溶于熱乙醇、二甲基亞砜（DMSO）和稀氫氧化鉀溶液[3]。鑒于活性成分的藥效發揮與其吸收特性密切相關，而目前對芹菜素體內吸收特性的研究較少，本試驗采用Caco-2單層細胞模型研究芹菜素的攝取特性，為含芹菜素的中藥及其制劑的劑型設計提供藥動學依據。
1 細胞、儀器與試藥
Caco-2細胞株購自武漢博士德生物工程有限公司，試驗所用細胞傳代數為20～40代。
1220LC高效液相色譜儀（美國Aglient公司），XS105型電子天平（德國梅特勒-托利多公司），TDL-40B型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備總廠），CO-150型二氧化碳孵箱（美國NBS公司），MX6R型倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），SK-1型快速漩渦混合器（江蘇金壇醫療儀器廠），pHS-3型精密pH計（上海精科雷磁儀器廠），SpectraMax190酶標儀（美國，Molecular Devices公司）。
芹菜素對照品（apigenin，批號150623，純度≥98%），上海谷研實業有限公司；DMEM培養基、非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液、胰蛋白酶、Hanks平衡鹽溶液（HBSS）、磷酸鹽緩沖液，美國Hyclone公司）；胎牛血清，美國Gibco公司；BCA蛋白分析試劑盒，美國Thermo公司；12孔培養板，美國Costar公司；增強型RIPA裂解液（批號AR0102-100），武漢博士德生物工程有限公司；維拉帕米（批號100223-200102）、環孢菌素A（批號130495-201303），中國食品藥品檢定研究院；二甲基亞砜（分析純），Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純），美國Fisher Scientific公司；超純水（自制）。
2 方法與結果
2.1 Caco-2細胞中芹菜素測定方法的建立
2.1.1 色譜條件
COSMOSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.2%磷酸（40∶60），流速1 mL/min，檢測波長340 nm，進樣量20 ?L，柱溫25 ℃。
2.1.2 專屬性試驗
在“2.1.1”項色譜條件下測定空白細胞混懸液、空白細胞混懸液+芹菜素對照品、芹菜素細胞攝取樣品，色譜圖見圖1。芹菜素細胞攝取樣品的保留時間為18.78 min，空白細胞混懸液+芹菜素對照品和芹菜素細胞攝取樣品的特征峰保留時間一致，空白細胞混懸液在保留時間內無雜質干擾，芹菜素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度>1.5，理論塔板數>3000。
2.1.3 線性關系考察
精密稱取芹菜素對照品適量，以Hanks平衡鹽溶液-空白細胞裂解液-甲醇（2∶2∶96）混合液溶解稀釋為0.33、1.30、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 ?g/mL系列濃度的芹菜素對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，外標法定量，以芹菜素峰面積（A）對濃度進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程A=1 000 000X-220 881（r=0.999 4），表明芹菜素在0.33～80.00 ?g/mL范圍內線性關系良好。
2.1.4 精密度試驗
按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質量控制樣品，按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積。1 d內重復測定6次，日內精密度RSD為0.068%～0.521%；每日測定1次，連續測定6 d，日間精密度RSD為1.36%～4.22%。表明儀器精密度良好。
2.1.5 穩定性試驗
按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質量控制樣品，按“2.1.1”項下色譜條件測定樣品在37、25 ℃條件下放置3 h及在4、-20 ℃條件下放置3 d的穩定性，記錄峰面積。結果芹菜素RSD分別為0.09%～0.40%、0.055%～0.57%、1.91%～2.47%、1.14%～3.97%。表明樣品穩定性良好。
2.1.6 重復性試驗
按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質量控制樣品各6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果RSD為1.57%～4.82%，表明本方法重復性良好。
2.1.7 加樣回收率試驗
按“2.1.3”項下方法分別配制芹菜素低、中、高濃度（5、25、50 ?g/mL）的質量控制樣品，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣3次，記錄峰面積，計算回收率。結果回收率分別為91.87%、98.24%、104.46%，符合測定要求。
2.2 芹菜素對Caco-2細胞生長的影響
2.2.1 細胞培養
將Caco-2細胞培養于10%DMEM高糖培養液（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%非必需氨基酸等）中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，當細胞達到80%～90%融合時，取對數生長期的Caco-2細胞，用胰酶消化后，用10%完全培養液混懸，調整細胞密度至適宜濃度（約5×105個/mL），置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。
2.2.2 形態學觀察
取指數生長期的Caco-2細胞，按“2.2.1”項下方法消化分散制備單細胞懸液，調整細胞密度，以5×104個/孔接種于96孔板，培養24 h后更換新培養基，每孔加入200 ?L不同濃度的芹菜素溶液（芹菜素終濃度為0.5、5、15、25、50、100、200、400 ?g/mL），DMSO體積分數<0.5%，每個濃度設置6個復孔，對照組加入新鮮10%DMEM高糖培養液代替芹菜素溶液，培養48 h后置于顯微鏡觀察對照組和實驗組的細胞大小、形態、生長密度、樹突形態及融合狀態等。結果對照組細胞生長良好，形態正常。加入不同濃度芹菜素溶液后，細胞數量和形態均出現了不同程度的變化：濃度<25 ?g/mL時，細胞形態和數量均無明顯變化；濃度為50 ?g/mL時，細胞數目顯著減少，形態有較明顯變化；濃度為100 ?g/mL時，出現細胞分布稀疏，樹突明顯減少；濃度為400 ?g/mL時，細胞樹突減少或消失，不能相互融合形成網狀結構。細胞形態見圖2。鑒于芹菜素質量濃度對細胞形態及數量存在影響，攝取試驗應設定濃度在100 ?g/mL以下。
2.2.3 芹菜素對Caco-2細胞增殖率的影響
采用MTT法檢測細胞活性。細胞懸浮液處理同“2.2.2”項下操作，培養基作調零孔為空白組，不含藥物孔為陰性對照組，待測物為實驗組，均于孵育24、48、72、96 h每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 ?L，培養箱中孵育4 h，棄去培養液和MTT，向各孔中加入150 ?L DMSO，溶解殘留的MTT甲臜結晶，震蕩混勻后用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），計算細胞增殖率，確定待測物對Caco-2細胞的安全濃度范圍。細胞增殖率（%）=（實驗孔OD值-空白孔OD值）÷（對照孔OD值-空白孔OD值）×100%[4]。不同濃度芹菜素對Caco-2細胞增殖率的影響見表1?？梢姡鄄怂貪舛?lt;200 ?g/mL，細胞增殖率均大于85%，因此，后續考察芹菜素濃度對攝取的影響設定濃度應小于200 ?g/mL。
2.3 芹菜素在Caco-2細胞的攝取
2.3.1 細胞培養
將Caco-2細胞按“2.2.1”項下方法培養后，用10%完全培養液混懸，調整細胞密度至6×104個/mL，接種于12孔板內，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養14 d，測定細胞跨膜電阻>300 Ω·cm2，可用于藥物攝取實驗[5]。
2.3.2 樣品處理
將細胞培養板從培養箱內取出，吸棄含藥培養液，用4 ℃ HBSS快速清洗3遍，加入胰蛋白酶消化后以完全培養基終止消化，收集細胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入4 ℃ HBSS 500 ?L重懸細胞，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入500 ?L RIPA細胞裂解液裂解細胞，吹打混勻，超聲處理（250 W，25 kHz）25次，20 s/次（冰上操作），12000 r/min離心5 min，所得上清液一部分以BCA法測定蛋白定量，另一部分加入3倍甲醇，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，氮氣吹干，加50 ?L甲醇復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液20 ?L，采用HPLC測定芹菜素含量，記錄峰面積。芹菜素的細胞內攝取量以?g（藥物）/mg（蛋白）表示[6]。
2.3.3 影響因素考察
細胞培養14 d，吸去培養液，用HBSS清洗3次，每孔加入含藥的HBSS溶液1 mL，分別考察培養時間、濃度、溫度、pH值及P-糖蛋白（P-gp）抑制劑維拉帕米和環孢素A對芹菜素攝取的影響。
2.3.3.1 時間對Caco-2細胞攝取的影響
取20 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細胞在37 ℃培養箱中分別孵育0、10、30、60、90、120、180、210、270 min，計算攝取量，結果見圖3。可見，芹菜素在Caco-2細胞中的攝取量在0～180 min范圍內隨著培養時間的增加而增加，其后攝取量下降。因此，后續實驗確定攝取時間為180 min。
2.3.3.2 濃度對Caco-2細胞攝取的影響
取不同濃度芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細胞在37 ℃培養箱中孵育180 min，考察不同給藥濃度（2、3、6、12.5、25、50、100、150、200 ?g/mL）對Caco-2細胞攝取芹菜素的影響，結果見圖4?？梢姡幬餄舛仍?.00～100.00 ?g/mL范圍，細胞攝取速率與藥物濃度具有一定的線性關系，符合一級動力學過程，可視為被動擴散，確定細胞攝取濃度在100 ?g/mL以內。
2.3.3.3 溫度對Caco-2細胞攝取的影響
取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細胞分別在4、25、37 ℃條件下中孵育180 min，考察不同溫度對Caco-2細胞攝取芹菜素的影響，結果見圖5?？梢?，在設定的考察溫度范圍內，芹菜素的細胞攝取量與溫度近似呈線性增加。
2.3.3.4 pH值對Caco-2細胞攝取的影響
取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液與Caco-2細胞分別置于37 ℃，pH 5.00、6.00、7.40、8.00條件下孵育180 min，考察不同pH值對細胞攝取的影響，結果見圖6?？梢?，在pH 5.00～7.40范圍內，細胞攝取量持續增加，之后下降，在設定范圍內以pH 7.4時藥物攝取量最大，后續實驗pH值設為7.4。
2.3.3.5 P-糖蛋白抑制劑對Caco-2細胞攝取的影響
取25 ?g/mL芹菜素的HBSS供試液，分別加入P-gp抑制劑維拉帕米和環孢素A，在pH 7.40、37 ℃環境中孵育180 min，考察P-gp抑制劑對Caco-2細胞攝取芹菜素的影響，結果見表2?？梢?，加入P-gp抑制劑維拉帕米和環孢素A后，Caco-2細胞對芹菜素攝取量降低（P<0.05）。
3 討論
新疆維藥材芹菜根是傘形科植物旱芹Apium graveolens L.的干燥根，收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·維吾爾藥分冊》[7]和《維吾爾藥材標準》[8]，具有明確的護肝、降壓及調脂作用[9-12]。芹菜素是芹菜根的主要藥效成分[13]，其體內吸收特性研究可為其劑型設計提供藥動學依據。
Caco-2細胞來源于人的結腸癌細胞，具有小腸微絨毛結構，可以表達多種藥物載體和酶，被廣泛用于藥物吸收機制的研究。本試驗采用Caco-2細胞模型研究芹菜素的攝取特性，以MTT法考察芹菜素對Caco-2細胞的毒性，表明芹菜素濃度對細胞形態、數量及增殖率存在影響，細胞形態學觀察表明攝取實驗設定濃度應小于100 ?g/mL，增殖率測定結果表明攝取實驗設定濃度應小于200 ?g/mL，可能由于芹菜素是難溶性藥物，漂洗不到位，死亡細胞釋放殘留的酶可能還原了MTT而造成實驗的誤差，而且細胞形態觀察是主觀判斷實驗結果，也會存在一定的誤差。因此，低濃度芹菜素對Caco-2細胞無毒性。
芹菜素的攝取量受時間、濃度、pH值、溫度的影響，并呈一定的劑量依賴性。在0～180 min其攝取量隨時間的增加而增加，180 min后呈下降趨勢；在2.00～100 ?g/mL范圍內，其攝取量隨著給藥濃度的增大而增加，并呈一級動力學過程特征，超過100 ?g/mL則下降；當pH<7.4時，其攝取量隨著pH值升高而增加，pH>7.4時攝取量下降，表明中性條件下攝取較好，酸性條件下不利于其攝取，芹菜素在小腸中的吸收可能較胃中好；在設定的考察溫度范圍內，其攝取量隨著溫度的上升而增加，37 ℃條件下更有利于Caco-2細胞攝取芹菜素。
P-gp是Caco-2細胞中的主要外排蛋白之一，P-gp抑制劑可抑制其外排作用，增加底物濃度。本實驗以典型的P-gp抑制劑維拉帕米和環孢素A考察P-gp對芹菜素攝取的影響。當加入維拉帕米和環孢素A后，芹菜素的細胞攝取量降低（P<0.05），表明P-gp未參與其吸收過程，即芹菜素不是P-gp的底物，其攝取量降低的機制需進一步探討。
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