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王盛++陳莉++馮藝戎++蔡敏
摘要：目的 改進熱毒清口服液的質量標準。方法 采用薄層色譜法對方中的甘草、射干、黃芩進行鑒別；采用高效液相色譜法測定熱毒清口服液中黃芩苷的含量。結果 薄層色譜法能夠鑒別出甘草、射干、黃芩的特征斑點；黃芩苷在53.60～536.00 ?g/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 99），平均加樣回收率為99.85%，RSD=0.63%（n=6）。結論 本方法操作簡單，準確可靠，可有效控制熱毒清口服液的質量。
關鍵詞：熱毒清口服液；薄層色譜法；高效液相色譜法；質量控制
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.018
中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）03-0075-03
Improvement of Quality Standard of Reduqing Oral Liquid WANG Sheng1，2， CHEN Li1，2， FENG Yi-rong1，2， CAI Min1 （1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China； 2. State Administration of National Chinese Drugs Medicament Laboratory of Grade 3， Hefei 230031， China）
Abstract： Objective To improve the quality standard of Reduqing Oral Liquid. Methods TLC was used to identify the featured spots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Scutellariae Radix； HPLC method was usded to detect the contents of Baicalin in Reduqing Oral Liquid. Results TLC could identify the featured spots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma， Belamcandae Rhizoma and Scutellariae Radix； Baicalin was detected in range of 53.60–536.00 ?g/mL with good linear relationship （r=0.999 99）， the average recovery rate was 99.85%， and RSD was 0.63% （n=6）. Conclusion The method is simple， accurate and reliable， which can be applied to the quality control of Reduqing Oral Liquid.
Key words： Reduqing Oral Liquid； TLC； HPLC； quality control
熱毒清口服液為安徽中醫藥大學第一附屬醫院臨床專家，依據中醫學家姜春華的“截斷扭轉”學術理論，以“清熱解毒涼血，疏風散結消瘀”為治法，創制的在江淮地區具有廣泛影響的新安名方制劑。該制劑處方由重樓、黃芩、板藍根等7味藥組成，具有抗病毒、抗菌、解熱鎮痛等作用[1]，用于治療流行性感冒，在醫院臨床應用已近30年。為了更好地控制該制劑的質量，保證臨床使用的安全性和穩定性，本研究對熱毒清口服液的質量控制方法進行改進，增加甘草、黃芩和射干的薄層鑒別，同時采用HPLC測定黃芩中黃芩苷的含量。
1 儀器與試藥
Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD紫外檢測器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置和自動進樣器），安捷倫公司；CAMAG熒光燈，瑞士CAMAG公司；定量毛細管，瑞士CAMAG公司；Sartorius BP211D十
基金項目：安徽省衛生廳中醫藥科研課題（2012ZY20）
通訊作者：馮藝戎，E-mail：18655182623@163.com
萬分之一電子天平，德國塞多利斯公司；HH-S型水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠。
甘草對照藥材（批號120904-201117）、黃芩對照藥材（批號120955-200406）、重樓對照藥材（批號121060-201007），中國食品藥品檢定研究院；熱毒清口服液（批號20131227、20140312、20140402），安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心；色譜甲醇和乙腈，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。
2 方法與結果
2.1 薄層色譜鑒別
2.1.1 甘草 取本品10 mL，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[2]80。取甘草藥材l.103 g，加乙醚40 mL，超聲處理30 min，過濾，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，按供試品溶液制備方法制得對照藥材溶液。按處方量及工藝制備缺甘草的陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液各0.5 ?L，分別點于同一硅膠G薄層板（用1%NaOH溶液浸漬晾干，105 ℃活化15 min）上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。
2.1.2 黃芩 取本品30 mL，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，加鹽酸調pH值為1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取黃芩對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制得對照藥材溶液。按處方量及工藝制備缺黃芩的陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液4 ?L、對照藥材溶液2 ?L、陰性對照溶液4 ?L，分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵試液，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[3]。
2.1.3 射干 取本品30 mL，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，加鹽酸調pH值1～2，用乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取射干對照藥材1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。按處方量及工藝制備缺射干的陰性對照溶液。照薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各4 ?L、陰性對照溶液5 ?L，分別點于聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇（10∶5∶1）為展開劑，預飽和30 min，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾[2]267。
2.2 黃芩苷含量測定
2.2.1 色譜條件 色譜柱為Analytical C18（5 ?m，4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇-0.4%磷酸水（47∶53），檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量5 ?L[2]282。理論板數按黃芩苷峰計算不低于2500。
2.2.2 溶液的制備
2.2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取本品1 mL，加乙醇定容至10 mL，稱定質量，超聲處理（功率135 W，頻率59 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。
2.2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品5.36 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按熱毒清口服液處方，稱取1/10處方量（缺黃芩）的藥材，按工藝制得陰性溶液。精密吸取陰性溶液1 mL，按供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。
2.2.3 專屬性試驗 分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各5 ?L，注入色譜儀中，測定，色譜圖見圖1?？梢姡┰嚻飞V圖在與黃芩苷峰相應的出峰時間上，有對應峰出現，且陰性對照無干擾峰出現。
2.2.4 線性關系考察 精密吸取黃芩苷對照品溶液（0.536 mg/mL）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5 ?L，依次注入色譜儀中，按上述色譜條件測定，以黃芩苷進樣量為橫坐標，相應的峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=2714.828 48X+4.555 6，r=0.999 99（n=6）。黃芩苷在0.268～2.680 ?g范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。
2.2.5 精密度試驗 精密吸取黃芩苷對照品溶液5 ?L，連續進樣6次，依法測定，結果平均峰面積為7254.4，RSD=0.77%，表明儀器精密度良好。
2.2.6 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液5 ?L，每隔2 h進樣1次，依法測定并計算，結果黃芩苷峰面積RSD=0.20%，表明供試品溶液在10 h內穩定。
2.2.7 重復性試驗 精密量取樣品（批號20131216）1 mL，平行6份，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，依次進樣測定，結果黃芩苷的平均峰面積為1448.516 7，RSD=0.1795%，表明本方法重復性良好。
2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取樣品（批號20131216）0.5 mL，平行9份，分別加入黃芩苷對照品適量，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，依次進樣，依法測定。結果平均回收率為99.85%，RSD=0.63%，表明該方法準確可靠。
2.2.9 樣品含量測定 取6個批樣品，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，依次進樣，依法測定，結果見表1。
3 討論
熱毒清口服液為復方制劑，成分復雜。為了更好地保證該制劑的藥品質量、提高臨床療效，本試驗對該制劑處方藥味進行了定性鑒別研究，在原有質量標準的基礎上，增加了方中甘草、黃芩、射干的薄層色譜鑒別，結果表明該方法專屬性強，重復性好，無干擾，斑點清晰；采用HPLC對該制劑中主要有效成分進行了含量測定研究，增加了在該制劑中含量較高的黃芩苷含量測定指標，方法學考察結果表明，本方法精密度高，重復性好。
由于板藍根與大青葉的成分相似[4]，因此，本試驗對板藍根與大青葉進行合并鑒別研究，采用藥典中板藍根項下薄層鑒別方法，結果雙缺陰性試驗有干擾，故放棄該制劑中板藍根與大青葉的薄層鑒別。在重樓的薄層鑒色譜鑒別中，首先采用藥典中重樓項下薄層鑒別方法，供試品色譜在與對照藥材色譜相應的位置沒有對應斑點；采用文獻[5]方法，陰性試驗結果有干擾，考慮原因為其他成分的干擾，故放棄該制劑中重樓的薄層鑒別。
HPLC測定熱毒清口服液中黃芩苷的含量試驗中，對流動相甲醇-0.4%磷酸水（47∶53）與乙腈- 0.05%磷酸水（25∶75）進行了考察[6-7]。結果以乙腈- 0.05%磷酸水（25∶75）為流動相時，黃芩苷分離度較差，且降低流速后（0.8 mL/ min）黃芩苷分離度R<1.5，對稱因子T>1.05，仍然較差；以甲醇-0.4%磷酸水（47∶53）為流動相，當進樣量為10 ?L時，黃芩苷分離度較好，但峰的對稱因子T>1.05，調整進樣量為5 ?L時，黃芩苷分離度R>1.5，對稱因子T在0.95～1.05范圍內，符合要求。故最后選用以甲醇- 0.4%磷酸水（47∶53）為流動相，進樣量為5 ?L，作為黃芩苷的含量測定條件。
參考文獻：
[1] 黃升海，馮曉亮，劉偉.熱毒清口服液抑制呼吸道合胞病毒的體外實驗研究[J].中藥材，2009，32（4）：579-581.
[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.
[3] 季申，毛秀紅，張彤，等.茵梔黃注射液質量標準研究[J].中成藥， 2009，31（12）：1862-1867.
[4] 王瑞，楊海英，楊琪偉，等.板藍根的質量標準研究[J].中草藥，2010， 41（3）：478-480.
[5] 鄭艷平，林壯民.藍菊抗病毒口服液的薄層鑒別[J].中國醫藥導報， 2010，7（22）：76-78.
[6] 李玲玲，趙蘭芬.清開靈不同制劑中黃芩苷的含量測定[J].藥物分析雜志，2011，31（5）：950-953.
[7] 劉學杰，姜慧禎，林娜.雙貝糖漿中黃芩苷的含量測定[J].西北藥學雜志，2011，26（1）：8-10.
（收稿日期：2016-01-06）
（修回日期：2016-05-17；編輯：陳靜）
